Cilvēka aizkuņģa dziedzera Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas medicīniskās tehnoloģija

  1. Izvērsts medicīnas tehnoloģijas metodes apraksts
  2. Cilvēka aizkuņģa dziedzera Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas medicīniskās tehnoloģija

  3. I. Vispārīgie jautājumi

    1. Praktiski cukura diabēta ārstēšana tika uzsākta 1922. gadā, kad parādījās pirmie ziņojumi par insulīna atklāšanu. Terapija ar
  4. insulīnu būtiski pagarina slimnieku dzīvi, bet nenovērš dažādās sekundārās komplikācijas. Tās var novērst tikai ar aizkuņģa dziedzera vai tā šūnu transplantācijas palīdzību. Visa dziedzera transplantācija ir ļoti sarežģīta un pēc tās saglabājas augsta letalitāte. Pirmie minējumi par iespēju izmantot Langerhansa saliņu šūnas cukura diabēta ārstēšanā attiecas uz pagājušā gadsimta 70-ajiem gadiem.
    1. Langerhansa saliņu šūnu transplantācija ir cukura diabēta ķirurģiskās ārstēšanas metode, kurā donora aizkuņģa dziedzera salu
  5. šūnas pārstāda recipientam. Transplantācijai var izmantot no miruša cilvēka iegūta orgāna šūnas.
  6. Svarīgākie etapi saliņu šūnu transplantācijas mērķa sasniegšanai:
    1. 1. donora sagatavošana, aizkuņģa dziedzera izņemšana, konservācija un transportēšana;
    2. 2. šūnu izdalīšana, attīrīšana, kultivēšana un imunomodulācija;
    3. 3. šūnu transplantācijas tehnika, ķirurģisko komplikāciju profilakse;
    4. 4. imunosupresija, imunoloģiskais monitorings;
    5. 5. pareiza pacientu atlase transplantācijas veikšanai.
  7. Tehnoloģijas mērķi: Atjaunot insulīna sintēzi I tipa cukura diabēta slimniekiem, kavēt nopietnu cukura diabēta blakņu attīstīšanos.
  8. Sagaidāmie rezultāti: pilna vai daļēja insulīnneatkarība; nopietno blakņu (retinopātija, neiropātija, nefropātija) attīstības aizkavēšana; cukura diabēta gaitas stabilizācija (savlaicīga hipoglikēmikas sajušana u.c.).
  9. II. Nosacījumi cilvēka aizkuņģa dziedzera Langerhansa saliņu šūnu transplantācijai

  10. 1. Pirms katras saliņu šūnas medicīniskās tehnoloģijas (MT) pielietošanas nepieciešama pacienta un (vai) viņa likumiskā pārstāvja informēšana par slimības ārstēšanas metodi, šūnu transplantācijas un imūnsupresīvās terapijas plānu, labvēlīgiem rezultātiem, zināmiem riskiem un komplikācijām, un jāsaņem rakstiski apstiprināta pacienta un/vai viņa likumiskā pārstāvja piekrišana ārstēšanas metodei un plānam (informētā pacienta piekrišanas forma).
  11. 2. Potenciālā donora atlasi un orgānu izmantošanu veic atbilstoši likumos un normatīvajos aktos noteiktajām prasībām.
  12. Medicīniskā tehnoloģija tiek realizēta daudzprofila slimnīcās vai diabēta izpētes centros ar endokrinoloģijas, ķirurģijas, transplantaloģijas, invazīvās radioloģijas, radioloģijas, laboratoriskās izmeklēšanas nodaļām, šūnu transplantācijas laboratoriju. MT realizējošā slimnīca veic recipienta sagatavošana saliņu šūnu transplantācijai (indikāciju un kontrindikāciju izvērtēšana pēc atlases kritērijiem, gaidīšanas saraksta veidošana un atjaunošanu), recipienta izmeklēšanu, nodrošina pacientu ambulatoro novērošanu un imūnsupresīvo terapiju.
  13. 3. Indikācijas un kontrindikācijas Langerhansa saliņu šūnu transplantācijai

  14. I tipa labili, ar rekurentu hipoglikēmiju cukura diabēta slimnieki, kas slimo vairāk par 5 gadiem, kuriem ir nepieciešama nieru transplantācija un pēcoperācijas imūnsupresija.
  15. Optimāls pacientu vecums 18 - 50 gadi ar negatīvu C- peptīda līmeni; glomerulāro filtrāciju vecuma normas robežās; pacienti ar smagām hipoglikēmijas lēkmēm; pacienti ar progresēšējošām mikrovaskulārām diabēta komplikācijām (proliferatīva retinopātija, makulas tūska, mikroalbuminūrijas, progresējoša polineiropātija u.c.); pacientam nepastāv absolūtas kontrindikācijas operācijai; pacients ir emocionāli stabils, motivēts veselīgam un aktīvam dzīves veidam un pakļaujas ārsta norādījumiem un ārstēšanas taktikai, ir labvēlīga ģimene, kas gatava ilgstošam atbalstam.
  16. Absolūtās kontrindikācijas Langerhansa saliņu šūnu transplantācijai:
    1. · ļaundabīgi jaunveidojumi;
    2. · HIV pozitīvi pacienti;
    3. · pacienti ar aktīvu infekciju – sepse, tuberkuloze, hepatīts;
    4. · hroniski norisoša psihoze;
    5. · smaga sirds vai citu dzīvībai svarīgu orgānu mazspēja, kas neļauj veikt saliņu šūnu transplantāciju;
    6. · lielas insulīna devas diabēta ārstēšanā (>0,7 vien/kg dienā);
    7. · ķermeņa masas indekss > 28; asins recēšanas traucējumi;
    8. · aknu slimības (portāla hipertensija, žultsakmeņi, aknu hemangioma, palielināti aknu funkciju testi);
    9. · C- peptīds pozitīvs (>0,3 ng/ml pēc stimulācijas);
    10. · nieru mazspēja (kreatinīns asinīs > 135 μmol/l vai kreatinīna klīrenss <85ml/min/1,73 m2);
    11. · makroalbuminūrija (>300 mg/24st);
    12. · aktīva kuņģa vai 12- pirkstu zarnas čūla;
    13. · nekontrolējama hiperlipidēmja (LDL holesterols >3,4 mmol/l, triglicerīdi> 2, mmol/l);
    14. · antikoagulantu (izņemot aspirīna) lietošana;
    15. · alkohola vai citu vielu atkarība;grūtniecība vai grūtniecības plānošana.
  17.  
  18. Relatīvās kontrindikācijas:
    1. · jebkura lēni norisoša infekcija, visiem iespējamiem hroniskas infekcijas avotiem jābūt sanētiem pirms transplantācijas;
    2. · koronārā sirds slimība, ja miokarda revaskularizācija iespējama, tā jāveic pirms saliņu šūnu transplantācijas;
    3. · smadzeņu asinsrites traucējumi;
    4. · pacienta nelīdzestība.
  19. III. MT realizācijas algoritmi

  20. 1. Recipienta atlase, izmeklēšana un iekļaušana Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas recipientu gaidīšanas sarakstā.
  21. 1.1. Potenciālā donora atlasi un orgānu izmantošanu veic atbilstoši likumos un normatīvajos aktos noteiktajām prasībām.
  22. 1.2. Recipienta izmeklēšana: specifiska recipienta izmeklēšana saliņu šūnu transplantācijai tiek veikta pēc tam, kad pacients saņēmis aptverošu informāciju par saliņu šūnu transplantāciju un parakstījis Pacienta informētās piekrišanas formu.
  23. Imunoloģiskie izmeklējumi: asins grupa un rēzus faktors; cilvēka leikocitārās saderības fenotipa noteikšana – HLA I klases A un B lokuss un HLA II klases DR lokuss. Kopējo HLA presensibilizācijas līmeni nosaka pret 20 testa - donoru paneli;
  24. recipienta seruma un konkrētā donora limfocītu krusteniskā saderības prove; hepatīta, HIV, sifilisa un citomegalovīrusa infekcijas marķeri. Recipienta serums tiek glabāts sasaldētā stāvoklī un atjaunots ik pēc trīs mēnešiem.
  25. 1.3. Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas recipientu gaidīšanas saraksts. Gaidīšanas saraksts tiek veidots un regulāri aktualizēts. Recipientu iekļaušana gaidīšanas sarakstā un asins paraugu paņemšana imunoloģiskiem izmeklējumiem pāra donors –recipients noteikšanai tiek veikta četras reizes gadā ik pēc trim mēnešiem;
  26. 1.4. Recipientu iekļaušana gaidīšanas sarakstā. Katram pacientam, kas tiek iekļauts gaidīšanas sarakstā, izveido recipienta karti, kurā norāda datus par pacientu un tā veselības stāvokli - slimības anamnēzi, pielietoto ārstēšanas metodi, laboratorisko, invazīvo un neinvazīvo izmeklējumu rezultātiem, speciālistu novērtējumu orgānu sistēmām un ārsta endokrinoloģa un transplantologa slēdzienus. Recipienta karti atjauno četras reizes gadā ik pēc trim mēnešiem.
  27. 2. Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas koordinācija un orgānu donora aizkuņģa dziedzera iegūšana
  28. 2.1. Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas koordinācija.
  29. Prasības donoriem tikpat nopietnas kā orgānu transplantācijas gadījumos. Orgānu donors – miris cilvēks. Orgānu donoru atklāšana un informācijas apkopošana un nodošana, imunoloģiskā testēšana pāra donors – recipients noteikšanai, donora orgānu funkciju pārbaude un infekciju kontrole, donora orgānu izmantošana pēc nāves transplantācijas koordinācija tiek veikta atbilstoši likumos un normatīvajos aktos noteiktajām prasībām un kārtībai. Smadzeņu nāves konstatēšana – konstatēšanu veic ārstu brigāde, atbilstoši likumos un normatīvajos aktos noteiktajām prasībām un kārtībai.
  30. 2.2. Visaktuālākais un arī vissarežģītākais ir šūnu iegūšana, lai tās iegūtu pietiekoši insulīnneatkarības sasniegšanai vienam pacientam no viena dziedzera. Donora atlases pamata kritēriji- vecums, aukstuma išēmijas laiks, ķermeņa masas indekss, nāves cēlonis, atrašanās laiks intensīvās terapijas nodaļā, seruma amilāzes vai lipāzes līmenis, glikozes un vasopresoru līmenis asinīs, medicīniska, sociāla informācija.
  31. Absolūtas kontrindikācijas donora – miruša cilvēka aizkuņģa dziedzera izņemšanai:
    1. · ļ undabīgs audzējs (izņemot galvas smadzeņu audzēju bez invāzijas);
    2. · antivielas pret HIV;
    3. · aktīva infekcija un nekontrolējama septicēmija;
    4. · patoloģiskas aizkuņģa dziedzera pārmaiņas;
    5. · disseminēta intravazāla koagulācija;
    6. · sirpveida anēmija vai citas hemoglobinopātijas;
    7. · i/v narkotiku lietotāji, alkoholisms;
    8. · smagi multiorgānu bojājumi.
  32.  
  33. 2.3. Relatīvas kontrindikācijas donora – miruša cilvēka aizkuņģa dziedzera izņemšanai:
    1. · donora slimības (cukura diabēts, alkoholisms, pankreatīts, sistēmiskas slimības);
    2. · laiks pēc sirdsdarbības apstāšanās vairāk nekā 30 minūtes;
    3. · ilgstoša aukstumišēmija;
    4. · primārs audzējs CNS;
    5. · arteriāla hipertensija;
    6. · fizioloģisks vecums lielāks par 70 gadi;
    7. · hepatīts C un B.
  34. 2.4. Donora – miruša cilvēka aizkuņģa dziedzera izņemšana
    1. 2.4.1. Donora – miruša cilvēka aizkuņģa dziedzera izņemšanas apstākļi:
      1. · donora aizkuņģa dziedzera izņemšana notiek ārstniecības iestādes operāciju zālē, kurā atbilstoši transplantācijas koordinātora sniegtajai informācijai atrodas orgānu donors;
      2. · donora aizkuņģa dziedzera izņemšana ir ķirurģiska operācija, kuru veic atbilstoši visām aseptikas prasībām;
      3. · donora uzturēšana smadzeņu nāves gadījumā – elpošanas, sirdsdarbības, asinsspiediena, asiņu piesātinājuma ar skābekli nodrošināšana un monitorēšana, medikamentoza terapija.
    2. 2.4.2. Miruša orgānu donora aizkuņģa dziedzera izņemšanas operācijas tehnika:
      1. · orgānu donoru novieto uz operāciju galda guļus uz muguras, lai nodrošinātu pieeju vēdera priekšējai sienai; operācijas lauka apstrādā ar dezinficējošiem šķīdumiem no jugulārās bedrītes līdz augšstilbiem; veic vidējās laparatomijas griezienu; operācijas norises laikā ir obligāta visu iespējamo hemostāzes veidu izmantošana.
      2. · Vēdera dobuma labajā pusē mobilizē resno zarnu, flexura hepatica. Zarnas nobīda uz augšu un pa kreisi. Pāršķeļ viscerālo vēderplēvi. Blakus bifurkācijas vietai mobilizē vēdera aortas un apakšējās dobās vēnas daļas. Perfūzijas nodrošināšanai maģistrālajos asinsvados ievieto kanili.
      3. · Zarnu traktu novieto atpakaļ to anatomiskajā pozīcijā. Secīgi mobilizē kuņģa lielo kurvatūru, pārdala lig. gastrocolica un lig. splenocolica. Kuņģa lielās kurvatūras un flexura lienalis mobilizēšanas laikā liģē visus asinsvadus. Pieturot aizkuņģa dziedzeri aiz liesas, izdala dziedzera mugurējo virsmu līdz vēdera aortai. Aizkuņģa dziedzeri novieto savā anatomiskajā atrašanas vietā.
      4. · Tālāk mobilizē flexura hepatica un divpadsmitpirkstu zarnas pakavu. To mobilizējot, veic Treica saites pārdalīšanu. Divpadsmitpirkstu zarnas pakavu nobīda pa kreisi. Pēc Kohera metodes, mobilizē aknu triādi un aizkuņģa dziedzera mugurējo virsmu līdz vēdera aortai vietā, kur projicējas truncus caeliacus. Tepat mobilizē apakšējās dobās vēnas daļu augstāk par vv. renales un uzliek turniketu. Divpadsmitpirkstu zarnu novieto natīvajā pozīcijā. Pēc tam nepieciešama kuņģa mazās kurvatūras un aknas kreisās daivas mobilizācija. Kuņģi un barības vadu nobīda pa kreisi. Dziļumā pārdala diafragmas kājiņas. Pēc tam mobilizē vēdera aortas zemdiafragmālo daļu.
      5. · Veic sistēmisku heparinizāciju. Caur barības vada zondi divpadsmitpirkstu zarnas pakavu piepilda ar antiseptisku šķīdumu. Caur kanili, kas ievietota aortā, uzsāk perfūziju ar atdzesētu (līdz +4°C) UW vai HTK (histidin-triptofan-ketoglutarāts) šķīdumu un vienlaicīgi veic kardioplēģiju, vēdera aortas zemdiafragmālās daļas liģēšanu un atslēdz mākslīgas plaušu ventilācijas aparātu. Splanhnoperfūzija tiek nodrošināta ar ne mazāk kā 8 litriem UW vai HTK šķīduma.
      6. · Pēc aizkuņģa dziedzera un nieru perfūzijas kvalitātes makroskopiskās izvērtēšanas, proksimāli un distāli hermetizē divpadsmitpirkstu zarnas pakavu, to nošķeļ ar steplera palīdzību. Atšķeļ liesu un vizuāli izvērtē perfūziju un perfuzāta atteci pa liesas vēnām.
      7. · No maģistrālajiem asinsvadiem atdala aizkuņģa dziedzeri un ievieto to Rikordi kamerā tālākai transportēšanai līdz Langerhansa šūnu izolēšanas laboratorijai.
  35. 2.5. Donordziedzera sagatavošana transportēšanai un transportēšana.
  36. Donora aizkuņģa dziedzeri ievieto sterilā hermētiskā, dubultkonteinerī no inerta materiāla ar tvertnes ārējās atdzesēšanas iespējām, kas pildīts ar UW vai HTK konservācijas šķīdumu kuru nodod transplantācijas koordinatoram, kas nogādā donora aizkuņģa dziedzeri līdz saliņu šūnu izdalīšanas vietai. Koordinātors ir atbildīgs par donora aizkuņģa dziedzera glabāšanu līdz saliņu šūnu izdalīšanas laboratorijai; informāciju par donoru izmeklējumu rezultātiem, orgānu izņemšanas operācijas gaitu, donora aizkuņģa dziedzera kvalitātes kontroles rezultātiem, pavadošos dokumentus un transportēšanas konteineri ar donora aizkuņģa dziedzeri, kā arī saliņu šūnu transplantāciju gaidošo pacientu sarakstu, ko koordinators nodod transplantāciju veicošās struktūras par transplantācijas veikšanu atbildīgajai personai.
  37. 3. Recipienta izmeklēšana un sagatavošana Langerhansa saliņu šūnu transplantācijai
  38.  
  39. 3.1. Recipienta neatliekama hospitalizācija
    1. 3.1.1. Recipientu hospitalizē neatliekamā kārtā transplantāciju veicošās iestādes endokrinoloģijas nodaļā.
    2. 3.1.2. Lēmumu par saliņu šūnu transplantācijai nepieciešami pacienta izmeklēšanu pieņem konsilijs, kura sastāvā ietilpst transplantāciju veicošās transplantoloģijas nodaļas dežūrārsts-endokrinologs, anesteziologs un transplantācijas koordinators. Recipienta izmeklēšana: pilna asinsaina; bioķīmiskie izmeklējumi (bilirubīns, ASAT, ALAT, kreatinīns, K, Na, kopējais holesterīns, ABH, ZBH asinīs; HCV, HBsAG, HIV; koagulogramma; cukura līmenis asinīs; C- peptīds asinīs; glikozētais hemoglobīns;urīna analīze, proteīnūrija; krūšu kurvja rentgenogramma, elektrokardiogramma; ķermeņa masas (kg) noteikšana; anesteziologa apskate.
    3. 3.1.3. Lēmumu par saliņu šūnu transplantācijas un indukcijas terapijas sākumu pieņem konsīlijs (transplantalogs, endokrinologs, radiologs, a-v ķirurgs.) lēmums par transplantāciju.
  40. 3.2. Recipienta sagatavošana Langerhansa saliņu šūnu transplantācijai:
    1. 3.2.1. kuņģa satura atsūkšana, klizma, operācijas lauka sagatavošana, venozās pieejas nodrošināšana;
    2. 3.2.2. indukcijas imūnsupresijas terapija - izmanto visās saliņu šūnu transplantācijas operācijās. indukcijas imūnsupresijas terapiju uzsāk, ja līdz operācijas sākumam ir vairāk par 5 stundām un turpina vai uzsāk transplantācijas operācijas laikā;
    3. 3.2.3. donora aizkuņģa dziedzera sagatavošana saliņu šūnu izdalīšanai.
  41. 3.3. Cilvēka aizkuņģa dziedzera Langerhansa saliņu šūnu izdalīšana transplantācijai
  42.  
  43. 3.3.1. Princips.
  44. Donora aizkuņģa dziedzera sagatavošana saliņu šūnu izdalīšanai notiek šūnu transplantācijas laboratorijas tīrajā telpā atbilstoši visām aseptikas prasībām.
  45. Aizkuņģa dziedzerī ir eksokrīnās un endokrīnās sekrēcijas šūnas. Eksokrīnās šūnas sekretē gremošanas enzīmus – tripsinogēnu, himotripsinogēnu, pankreātisko lipāzi, amilāzi – un ievada tos divpadsmitpirkstu zarnā. Endokrīnās sekrēcijas šūnas sintēzes produktus izvada asinsrites sistēmā. Šīs šūnas veido sakopojumus, ko sauc par Langerhansa saliņām. Viens cilvēka aizkuņģa dziedzeris satur aptuveni 1 milj. Langerhansa saliņu. Tās sastāda apmēram 2 % no dziedzera masas. Langerhansa saliņas sastāv no četru tipu šūnām:
    1. 1) a-šūnas, kas sintezē glikagonu (20-25 %);
    2. 2) b-šūnas, kas sintezē insulīnu (60-75 %);
    3. 3) d-šūnas, kas sintezē somatostatīnu;
    4. 4) PP-šūnas, kas sintezē pankreatisko polipeptīdu.
  46. Langerhansa saliņas ietvertas savienotājaudu kapsulā. Intaktu saliņu diametrs ³ 50 mm.
  47. MT tiek izmantota aizkuņģa dziedzera enzimātiska noārdīšana, kuras laikā pakāpeniski samazinās orgāna fragmentu lielums. Sildīšana aktivē enzīmus. Šķidruma periodiska atdalīšana, kolagenāzes inaktivēšana atdzesējot un šķidruma tūlītēja filtrēšana (saliņu atdalīšana no kolagenāzes) pasargā saliņas no noārdīšanās.
  48. Pēdējais etaps – centrifugācija blīvuma gradientā, lai attīrītu Langerhansa saliņas no eksokrīnajiem un citiem audiem.
  49. Izdalīšanas tehnoloģijā jāizmanto tikai endotoksīnu nesaturoši reaģenti.
  50. Jāsaglabā audu tilpums pieņemamās robežās, ņemot vērā, ka recipienta aknu vēnā parasti var ievadīt ne vairāk kā 5-7 ml.
  51. 3.3.2. Darba etapi
  52. 3.3.2.1.Aizkuņģa dziedzera sagatavošana
  53. 3.3.2.2. Enzimātiska sadalīšana ar kolagenāzi
  54. 3.3.2.3. Šūnu koncentrēšana – centrifugēšana
  55. 3.3.2.4. Saliņu attīrīšana – gradienta centrifugēšana ar centrifūgu COBE 2991
  56. 3.3.2.5. Attīrīto saliņu koncentrēšana centrifugējot
  57. 3.3.2.6. Saliņu sagatavošana transplantācijai:
  58. Saliņu preparātu suspendē 120 ml M199 un 2 % cilvēka albumīna. Uzglabā 4 °C.
  59. 3.3.2.7. Langerhansa saliņu kvalitātes pārbaude
  60. 3.3.2.7. 1. Mikroskopēšana
  61. Saliņas jāatšķir no eksokrīnajiem audiem, ganglijiem, limfmezgliem un tā saucamajām "membrānu bumbām". Mikromorfoloģijai jāapstiprina saliņu identitāte, jānosaka saliņu skaits, to morfoloģiskā integritāte, tīrības pakāpe, dzīvotspējīgo šūnu daudzums un jāsniedz priekšstats par saliņu mikrobioloģisko tīrību.
  62. Paraugu ielej Petri traukā un krāso ar ditizonu [dithizone (DTH) jeb diphenylthiocarbazone (DTZ)]: 50 mg DTZ/ 5 ml DMSO; 1 ml atšķaida ar 20 ml HBSS + 2 % FBS. Krāsa svaigi gatavota un filtrēta caur 0,22 mm diametra filtru pirms lietošanas. Mikroskopē x40. Saliņas nokrāsojas sarkanas, pārējās šūnas neiekrāsojas. Mikroskopējot gatavo saliņu preparātu, saskaita saliņas, izmērī to diametrus un aprēķina iegūto ekvivalento saliņu skaitu.
  63. Tā kā saliņas tilpums ir aptuveni proporcionāls saliņas rādiusa kubam, tad standartizācijas nolūkā ir svarīgi iedalīt saliņas klasēs pēc to diametra. Izmanto kalibrētu mikroskopa okulāra tīkliņu. Parasti neņem vērā saliņas, kuru diametrs ir mazāks par 50 mm. Tabulā redzams saliņu iedalījums klasēs, to vidējais tilpums un relatīvais konversijas faktors to pārvēršanai 150 mm diametra daļiņās. Šis faktors dod iespēju saliņu skaitu novērtēt ar ekvivalento saliņu skaitu (equivalent islet number, EIN). Beidzot nosaka saliņu kopējo tilpumu.
  64. Konversijas faktori ekvivalento saliņu skaita (EIN) aprēķināšanai

Saliņu diametra robežas (mm)

Vidējais tilpums (mm3 )

Konversija 150 mm diametra saliņās

50-100

294 525

n / 6,00

100-150

1 145 373

n / 1,50

150-200

2 977 968

n x 1,7

200-250

6 185 010

n x 3,5

250-300

11 159 198

n x 6,3

300-350

18 293 231

n x 10,4

350-400

27 979 808

n x 15,8

  1. Dzīvās šūnas var nokrāsot ar neitrālsarkano, bet mirušās – ar tripānzilo.
  2. 3.3.2.7.2. Mikrobioloģiskās tīrības pārbaude
  3. Analīzēm ņem 0,3 ml gatavā saliņu preparāta. Pa 0,1 ml izsēj Petri traukos uz trim mikrobioloģiskajām barotnēm: barojošā agara (Nutrient agar), universālās baktēriju (R2A) un sēņu barotnes (iesala agars).
  4. Barojošā agara barotni inkubē 37 °C, abas pārējās inkubē 20-27 °C līdz 2 nedēļām. Koloniju skaitīšanu veic katru dienu.
  5. Izdala un identificē izaugušo mikroorganismu tīrkultūras.
  6. 3.3.2.7.3. Izolēto saliņu dzīvotspējas pārbaude
  7. Izolētās saliņas kultivē Petri traukos 37 °C 5% CO2 atmosfērā RPMI-1640 ar 20 % FBS, 10 mM nikotīnamīda, 25 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, 100 U/ml penicilīna G, 100 mg/ml streptomicīna, 0,25 mg/ml amfotericīna B. Pēc 48 h nosaka dzīvo un nedzīvo šūnu (saliņu) skaitu. Mirušās nokrāsojas ar tripānzilo, bet dzīvās – nenokrāsojas.
  8. 3.3.2.7.4. Langerhansa saliņu funkcionalitātes – insulīna producēšanas – pārbaude
  9. Nosaka intracelulārā insulīna un insulīna sekrēcijas pamatlīmeni un insulīna producēšanas stimulācijas indeksu.
  10. 3.3.2.8. Rezultātu vērtējums
  11. Izolēšana uzskatāma par sekmīgu, ja no viena dziedzera iegūst vismaz 200 000 saliņu (ekvivalentās saliņas) ar tīrību ne mazāku par 50 %. Vismaz šāds daudzums saliņu nepieciešams vienai transplantācijai.
  12. 4. Darba gaita

  13. 4.1. Iepriekš sagatavojamie trauki un reaģenti:

· ditizona darba šķīdums (0,25 mg/ml): kolbā ielej 80 ml DMSO, nosver 200 mg ditizona un ieber kolbā ar DMSO, samaisa, ļaujot izšķīst. Izšķīdināto ditizonu pievieno 720 ml HBSS, samaisa, salej 50 ml centrifugēšanas mēģenēs pa 40 ml katrā un apzīmē, glabā –20 ° C.

· sterili 30 ml trauki (liberāzes šķīdināšanai ūdenī), citi sterili trauki, sterilas pincetes, šķēres, skavas, paplātes, šļirces, ledus gabaliņi –20° C;

· Nutrient agar barotne, R2A barotne un iesala agara barotne Petri traukos;5 % polividona joda šķīdums (polyvidonum iodine);

· ļaundabīgi jaunveidojumi;

· EuroFicoll darba šķīdumi: 1) d=1,077; 150 ml porcija; 2) d=1,100; 350 ml porcija); uzglabā ledusskapī 4º C. Sagatavošana aizņem divas dienas: pirmajā dienā EuroFicoll maisot šķīdina, otrajā dienā noregulē pH (7,4; ar 10 N NaOH) un autoklāvē;

· etiķskābes šķīdums: samaisa 57 ml ledus etiķskābes un 443 ml ūdens un pievieno 1 g BSA; šķīdumu drīkst glabāt sasaldētu -20 ° C.

  1. 4.2. Pirmās dienas darbi
  2. 4.2.1. Pirmais darbinieks apstrādā dziedzeri:
  3. Bioloģiskā kamerā izņem no transporta iepakojuma dziedzeri, noskalo ar aukstu (+4 °C) 5 % polividona joda šķīdumu un novieto uz sterilas paplātes, kas ievietota traukā ar ledu. Apkārtējo audu atdalīšana un aizkuņģa dziedzera dekapsulācija ar ķirurģiskām šķērēm un asinsvadu pinceti.
  4. Ar ķirurģisko šķēru, pincetes un asinsvadu aizspiedņu komplekta palīdzību mobilizē 12- pirkstu zarnu Pēc izvada daļas mobilizācijas 2 cm dziedzera dziļumā, 12- pirkstu zarna tiek atdalīta pārgriežot vietā, kur savienojas aizkuņģa ar dziedzera izvadu. Aizkuņģa dziedzera galva tiek atdalīta šķērsām, izvads vizualizējas un to kanilē. Hermetizācijai izvadkanāla siena tiek piešūta pie katetra ar nepārtrauktu šuvi. Dziedzeri kopā ar kateteri nosver.
  5. Ar sterilu pipeti paņem 1 ml transporta šķīduma, ielej sterilā Ependorfa mēģenē un apzīmē.
  6.  
  7. 4.2.2. Otrais darbinieks sagatavojas dziedzera noārdīšanai:
  8. · Ieslēdz ūdens vannu +37 °C. Sagatavo un noliek laminārā ledus vannu un aukstu UW vai HTK šķīdumu.

· Sagatavo liberāzes darba šķīdumu: 0,5 g (iepakojumu) liofilizētas liberāzes izšķīdina 20 ml injekciju ūdens. Turot uz ledus, 30 min. maisa, līdz izšķīst.

  1. Piezīme: izšķīdinātu liberāzi drīkst glabāt 2-8 °C līdz 2 h.
  2. · Pirms lietošanas liberāzes šķīdumu sterilizē, izlaižot cauri 0,22 mm poru diametra celulozes acetāta filtram. Atšķaida ar 200 ml silta (28-32 °C) UW vai HTK šķīdumu.

· Sagatavo ditizona šķīdumu: izņem no saldētavas darba šķīdumu. Atkausēto šķīdumu caur 0,22 mm poru diametra filtru iefiltrē sterilā mēģenē.

  1.  
    1.    · Bioloģiskā kamerā paņem un ieliek ledusskapī mēģeni ar analizējamo transporta šķīdumu. 
  2.  
  3. 4.2.3. Pirmais darbinieks veic dziedzera noārdīšanu:
  4. · ievada dziedzerī sagatavoto liberāzes darba šķīdumu un aizspiež ievadīšanas kanālu ar skavu. Ja dziedzeris > 100 g, to sagriež;

· Ievieto Rikordi kamerā, pievieno bumbiņas un atlikušo liberāzes šķīdumu;Rikordi kameru novieto termostatā (+37°C), pieslēdz pie kratītāja un savieno ar šķidruma cirkulācijas sistēmu, ko darbina peristaltiskais sūknis, ieslēdz.

  1. 4.2.4. Otrais darbinieks, sākot ar noārdīšanas 20. minūti, ik pēc 5-10 min. ņem, apstrādā un analizē noārdītā dziedzera paraugus:
  2. Nosaka saliņu atdalīšanās pakāpi mikroskopējot saliņas. Ar sterilu pipeti ņem 0,1 ml virsējā šķidruma un uznes uz priekšmetstikliņa; pievieno 0,1 ml ditizona šķīduma.
  3. Ja paraugā konstatē saliņas, tās atdala:
  4. Atslēdz cirkulāciju un sistēmu pārslēdz uz noārdītās suspensijas savākšanu traukiem, kur uz 1 l tilpuma ielieti atdzesēti 300 ml UW vai HTK šķīduma. Suspensiju koncentrē, centrifugējot 400 g 1000 apgr./min. 3 min. Pēc centrifugēšanas pudelē atstāj apmēram 150 ml, pārējo atsūc. Nogulsnes resuspendē un kombinē 1-2 250 ml tilpuma pudelēs, pievieno 200 ml UW vai HTK šķīduma. Centrifugē 400g 3 min. Atsūc virsējo šķidrumu, atstājot līdz 2 ml nogulšņu, tās suspendē.
  5.  
  6. 4.2.5. Saliņas attīra gradienta centrifugēšanā ar centrifūgu COBE 2991, kas savienota ar aukstuma iekārtu un lamināro skapi:
    1. 1. laminārā sagatavo COBE somu ar caurulēm, somu ievieto COBE centrifūgā un savieno caurules;
    2. 2. izņem no ledusskapja EuroFicoll darba šķīdumus un laminārā ielej tos gradienta gatavošanas ierīcē, ierīci pievieno COBE
    3.    centrifūgai;
    4. 3. iesūknē COBE centrifūgā apmēram 200 ml „smagā" EuroFicoll šķīduma;
    5. 4. iesūknē centrifūgā visu gradientu;
    6. 5. gradienta ierīces „smagās" frakcijas nodalījumā iepilda 20 ml (vai līdz 20 ml) saliņu suspensijas un iesūknē centrifūgā;
    7. 6. gradienta ierīces „smagās" frakcijas nodalījumā iepilda mazgāšanas šķīdumu – 30 ml UW vai HTK un centrifugē 7 min. 2300
    8.    apgr./min.;
    9. 7. savāc frakcijas: vispirms pa 50 ml, pēc tam pa 20 ml katrā no iepriekš sagatavotajiem flakoniem, kuros iepildīts pa 30 ml
    10.     UW vai HTK, izslēdz centrifūgu.
  7.  
  8. 4.2.6. Novērtē frakciju tīrības pakāpi:
    1. 1. mikroskopē;
    2. 2. aprēķina EIN.
  9.  
  10. 4.2.7. Apvienoto frakciju koncentrēšana centrifugējot:
    1. 1. apvieno tīrākās frakcijas;
    2. 2. pirmo reizi centrifugē 3 min. 1000 apgr./min.;
    3. 3. atmazgā ar UW vai HTK, otro un trešo reizi centrifugē pa 1 min. 1000 aprg./min.;
    4. 4. atmazgātās saliņas pilda somās, papildina ar M199, kas satur 2 % cilvēka albumīna, nepārsniedzot 150 ml tilpumu.
  11. 4.2.8. Pirmais darbinieks novieto saliņu preparātu glabāšanai un analīzēm:
    1. 1. 0,05 ml – uz priekšmetstikliņa, krāsošanai ar ditizonu;
    2. 2. 0,05 ml – uz priekšmetstikliņa, krāsošanai ar tripānzilo;
    3. 3. 0,2 ml – Ependorfa mēģenē, mikrobioloģiskās tīrības noteikšanai ;
    4. 4. 0,1 ml – Petri traukā, dzīvotspējas pārbaudei ;
    5. 5. 0,1 ml – Petrī traukā, insulīna producēšanas noteikšanai;
    6. 6. Pārējam – gatavo saliņu preparātam – nosaka tilpumu, novieto ledusskapī līdz transplantācijai un reģistrē protokolā
  12.  
  13. 4.2.9. Otrais darbinieks nosaka saliņu preparātu raksturojošos rādītājus, dzīvo saliņu daudzumu un tīrību.
  14. · paraugam uz priekšmetstikliņa pievieno 0,05 ml tripānzilā šķīdumu un 0,05 ml ditizona šķīduma;

· mikroskopējot apskata 50 šūnu sakopojumus, saskaitot dzīvo (neiekrāsoto) un mirušo (zili iekrāsoto) šūnu daudzumu;

  1. · aprēķina dzīvo un mirušo šūnu skaita attiecību pret šūnu kopskaitu, izsaka procentos;
  2. · mikroskopējot meklē, vai preparāts nav inficēts ar baktērijām un sēnēm. Ja jā, tad kopā ar pirmo darbinieku dod  
  3.   aptuvenu vērtējumu inficētības pakāpei;

· mikroskopējot sarkani krāsotās saliņas, izmēra to diametrus un pēc tabulas aprēķina iegūto ekvivalento saliņu skaitu;

  1. · rezultātus reģistrē protokolā.
  2.  
  3. 4.2.10. Pirmais darbinieks veic paraugu sagatavošanu ilgstošām analīzēm
  4. 4.2.10.1. Sagatavošanās saliņu dzīvotspējas pārbaudei:
  5. Sagatavo RPMI-1640 ar 20 % FBS, 10 mM nikotīnamīdu 25 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, 100 U/ml penicilīnu, 100 mg/ml streptomicīnu un 0,25 mg/ml amfotericīna. 4 ml RPMI-1640 pievieno 1 ml FBS, kā arī HEPES un antibiotikas. Pie parauga Petri traukā pielej 5 ml RPMI-1640 ar FBS, HEPES un antibiotikām. Petri trauku novieto CO2 termostatā +37 °C.
  6.  
  7. 4.2.10.2. Sagatavošanās saliņu insulīna producēšanas pārbaudei:
  8. Sagatavo RPMI barotni: 0,84 g RPMI šķīdina 100ml ūdens, pievieno 595 mg HEPES, noregulē pH. Pie parauga Petri traukā pielej 5 ml sagatavotā RPMI-1640. Petri trauku novieto CO2 termostatā +37 °C.
  9. 4.2.10.2.1 Intracelulārā insulīna un insulīna sekrēcijas pamatlīmeņa noteikšana:
    1. 1. pagatavo saliņu suspensiju ar 400 EIN/ml 2,8 mM glikozes šķīdumā;
    2. 2. 100 ml saliņu preparāta pievieno 0,9 ml acetāta bufera, 1 h atstāj +4 °C; pēc tam ievieto -20 °C;
    3. 3. veic šūnu lizēšanu: saliņas atkausē 1,9 ml etiķskābes šķīduma un novieto uz ledus;
    4. 4. saliņu suspensiju uz ledus sonificē 10 sek. (impulss 1 sek./ pauze 0,01 sek./ amplitūda 1 %) un glabā uz ledus;
    5. 5. šūnu supernatantu atšķaida 1/200: 10 ml insulīna ekstrakta (supernatanta) + 1990 ml 3,3 % BSA šķīduma;
    6. 6. insulīnu nosaka, izmantojot mikrodaļiņu imūnfermentatīvās analīzes metodi (MEIA), AxSYM sistēmu (Abbott Laboratories);
    7. 7. insulīna mērījumus veic nekavējoties vai analizējamos paraugus glabā +4 °C ne ilgāk par vienu nakti, vai arī glabā ilgāk,
      1. sasaldētus -20 °C, bet nekādā gadījumā paraugus nedrīkst vairākkārtīgi sasaldēt un atkausēt. Tieši pirms mērīšanas paraugu atšķaida 1/50 ar 3,3 % BSA šķīdumu: 10 ml parauga + 490 ml BSA (3,3 g BSA/ 100 ml ūdens, filtrē cauri 0,22 mm filtram). BSA šķīdumu drīkst glabāt sasaldētu -20 °C.
  10. 4.2.10.3. Paraugu uzsēšana mikrobioloģiskās tīrības pārbaudei:
    1. 1. Pa 0,05 ml no transporta šķīduma un gatavā preparāta paraugiem uzsēj uz NA barotnēm
    2. 2. Pa 0,05 ml no transporta šķīduma un gatavā preparāta paraugiem uzsēj uz R2A barotnēm
    3. 3. Pa 0,05 ml no transporta šķīduma un gatavā preparāta paraugiem uzsēj uz iesala agara barotnēm
    4. 4. NA barotnes novieto termostatā +37 °C
    5. 5. R2A un iesala agara barotnes novieto 20-27 °C
    6. 6. izlietoto materiālu novākšana, sterilizēšana, darba vietas sakārtošana un dezinficēšana.
  11. 4.3. Darba gaita – otrās dienas darbi
  12.  
  13. 4.3.1. Saliņu preparāta mikrobioloģiskās tīrības novērtēšana:
  14. · Nosaka baktēriju un sēņu koloniju skaitu Petri traukos: NA barotnē; R2A barotnē; Iesala agara barotnē.

· Petri traukus novieto iepriekšējās vietās inkubācijas turpināšanai

  1. · Aprēķina baktēriju un sēņu koloniju veidojošo vienību (kvv) daudzumu/ ml.
  1. · Rezultātus reģistrē protokolā.
  2. 4.3.2. Saliņu preparāta funkcionalitātes – insulīna producēšanas – pārbaude:
    1. 1. izņem no termostata insulīna pārbaudei paredzēto Petri trauku. Pagatavo saliņu suspensiju ar 400 EIN/ml;
    2. 2. sagatavo sterilus 2,8 mM un 20 mM glikozes šķīdumus RPMI barotnē, filtrē caur 0,22 mm poru diametra membrānu filtru,  
    3.     pievieno penicilīnu/streptomicīnu (10000 UI/ml / 10000 mg/ml) un FBS (gala konc. 20 %);
    4. 3. saliņu suspensiju sadala pa 100 ml (40 EIN), veic preinkubāciju 30 min. 37 °C 5 % CO2 atmosfērā;
    5. 4. atsūc un atdala preinkubācijas barotni, pievieno 200 ml RPMI ar 2,8mM glikozi, inkubē 1h 37 °C 5 % CO2;
    6. 5. atdala un savāc RPMI ar 2,8 mM glikozi, pievieno 200 ml RPMI ar 20 mM glikozi, inkubē 1h 37 °C 5 % CO2, atdala un
    7.     savāc RPMI ar 20 mM glikozi;
    8. 6. insulīnu nosaka, izmantojot mikrodaļiņu imūnfermentatīvās analīzes metodi (MEIA), AxSYM sistēmu (Abbott Laboratories);
    9. 7. insulīna mērījumus veic nekavējoties vai analizējamos paraugus glabā +4°C ne ilgāk par vienu nakti, vai arī glabā ilgāk,
    10.     sasaldētus -20°C, bet nekādā gadījumā paraugus nedrīkst vairākkārtīgi sasaldēt un atkausēt. Tieši pirms mērīšanas paraugu
    11.     atšķaida 1/50 ar 3,3% BSA šķīdumu: 10ml parauga + 490 ml BSA (3,3g BSA/ 100ml ūdens, filtrē cauri 0,22 mm filtram).
    12.     BSA šķīdumu drīkst glabāt sasaldētu -20° C;
    13. 8. rezultātus izsaka mUI/ml, un aprēķina saliņu preparāta stimulācijas indeksu pēc sekojošas formulas: indekss = koncentrācija
    14.    ar 20mM / koncentrācija ar 2,8 mM;
    15. 9. aprēķina insulīna sekrēcijas vērtību 40 EIN, kas stimulētas ar 2,8 un 20 mM glikozes, un izsaka mUI/40EIN/h. Lai to
    16.     izdarītu, iepriekšējais rezultāts, kas bija izteikts mUI/ml, jāsareizina ar 10, ja preparāts tika atšķaidīts 1/50.
  3.  
  4. 4.4. Darba gaita – trešās dienas darbi
  5.  
  6. 4.4.1. Saliņu preparāta mikrobioloģiskās tīrības novērtēšana:
  7. · nosaka baktēriju un sēņu koloniju skaitu Petri traukos: NA barotnē; R2A barotnē; Iesala agara barotnē;

· petri traukus novieto iepriekšējās vietās inkubācijas turpināšanai;

  1. · aprēķina baktēriju un sēņu koloniju veidojošo vienību (kvv) daudzumu/ ml. Rezultātus reģistrē protokolā.
  2. 4.4.2. Saliņu dzīvotspējas pārbaude:
  3. Izņem no termostata dzīvotspējas pārbaudei paredzēto Petri trauku. Petri traukam pievieno 0,1 % tripānzilā šķīdumu attiecībā 1:1. Mikroskopējot apskata 50 šūnu sakopojumus, saskaitot dzīvo (neiekrāsoto) un mirušo (nokrāsoto) šūnu daudzumu. Aprēķina, izsakot procentos, dzīvo šūnu skaita attiecību pret šūnu kopskaitu. Rezultātu reģistrē protokolā.
  4.  
  5. 4.5. Darba gaita – nākamo dienu (4.-10.) darbi
  6. 4.5.1. Saliņu preparāta mikrobioloģiskās tīrības novērtēšana:
  7. Nosaka baktēriju un sēņu koloniju skaitu Petri traukos: NA barotnē; R2A barotnē;iesala agara barotnē.
  8. Petri traukus novieto iepriekšējās vietās inkubācijas turpināšanai.
  9. Aprēķina baktēriju un sēņu koloniju veidojošo vienību (kvv) daudzumu (ml).
  10. Rezultātus reģistrē protokolā.
  11. 5. Donora aizkuņģa dziedzera Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas operācija recipientam.

  12. 5.1. Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas operāciju veic invazīvās radioloģijas kabinetā 12 – 48 stundu laikā pēc šūnu izdalīšanas. Šūnu infūziju recipienta aknās panāk ar portālās vēnas perkutāno katetrizāciju ultrasonogrāfijas (US) kontrolē.
  13. 5.2. Donora aizkuņģa dziedzera Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas operācijas tehnika:
    1. · recipienta novietošana uz operāciju galda guļus uz muguras, lai nodrošinātu pieeju vēdera priekšējai sienai;
    2. · indukcijas imūnsupresijas terapija.
    3. · Pirms procedūras transplantāta recipientam ievada sedatīvus līdzekļus.
    4. · Operācijas lauku apstrādā ar dezinficējošiem šķīdumiem. Labā starpribu rajonā veic vietējo anestēziju un US kontrolē punktē
    5.    labo portālo vēnu ar 22. izmēra adatu. Vienlaikus veic arī krāsu Doppler US izmeklēšanu aknu artēriju un vēnu vizualizācijai.
    6.    Caur adatu fluroskopijas kontrolē ievada 0,018 collas garu katetra vaduli galvenajā portālajā vēnā un virs tā novietoto
    7.    taisno 4-F katetru. Lai pārliecinātos par katetra precīzu atrašanos portālajā vēnā, pirms un pēc beta- šūnu infūzijas veic
    8.    portogrāfiju.
    9. · Caur ievadīto katetru 20 – 30 minūšu laikā lēni ievada 150 ml pagatavotās attīrītas beta- šūnu suspensijas ar 300000 –
    10.    800000 šūnām. Tieši pirms infūzijas šūnu suspensijai pievieno 1500 – 2000 SV heparīna.
    11. · Pirms un pēc procedūras ir nepieciešama arī spiediena mērīšana portālajā vēnā.
    12. · Procedūras beigās fluoroskopijas kontrolē lēni izvada katetru no intrahepatiskiem asinsvadiem un uzsāk enoksaparīna 6000
    13.    SV terapiju.
  14. 6. Pacienta ārstēšana pēc Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas operācijas

  15. 6. 1. Pacienta ārstēšana agrīnajā pēcoperācijas periodā:
    1. 6.1.1. pacienta stāvokļa stabilizācija intensīvās terapijas nodaļā (arteriālā spiediena, diurēzēs kontrole, laboratorijas testi, hemofiltrācija, palīgcirkulācija), hipotensīva, diurētiķu, antikoagulantu un antiagregantu terapija;
    2. 6.1.2. profilaktiskā imunosupresīvā terapija un uzturošās imūnsupresīvās terapijas uzsākšana;
    3. 6.1.3. profilaktiska pretvīrusu terapija;
    4. 6.1.4. imunosupresīvās terapijas efektivitātes kontrole (medikamentu līmeņa asinīs noteikšana);
    5. 6.1.5. infekcijas riska profilakse (antibakteriālā terapija);
    6. 6.1.6. transplantēto salīņu šūnu funkcionālā stāvokļa monitorēšana: tremes diagnostika (arteriālā spiediena kontrole, ultrasonoskopija, cukura līmenis asinīs, C- peptīds asinīs);
    7. 6.1. 7. tremes terapija (poliklonālo antivielu terapija).
  16.  
  17. 6.2. Pacienta ārstēšana un rehabilitācija pirmajā pēcoperācijas gadā:
    1. 6.2.1. Uzturošā imūnsupresīvā terapija.
    2. Ambulatorā dinamiskā novērošana un uzturošās imunosupresīvās terapijas kontrole endokrinoloģijas nodaļā 1 reizi nedēļā pirmajos trijos mēnešos pēc operācijas, turpmākās kontroles tiek nozīmētas regulāros intervālos, atkarībā no saliņu šūnu funkcijas un klīniskām indikācijām.
    3. 6.2.2. Pamatizmeklējumi: īsa slimības anamnēze; arteriālais spiediens, pulsa frekvence, ķermeņa svars; plazmas Na, K, Cl, kreatinīna, urea koncentrācija, cukura līmenis asinīs, C- peptīds, glikozilētais hemoglobīns; pilna asinsaina, urīna analīze; imūnsupresantu līmenis asinīs. Okulista, neiropatologa konsultācija.
  18. 6.3. Papildizmeklējumi
  19. Papildizmeklējumi, kas veicami donororgāna disfunkcijas gadījumā: precīza slimības anamnēze; pilnīgi fizikālie izmeklējumi; pilns hematoloģisko un bioķīmisko izmeklējumu komplekss, ietverot aknu proves un Ca koncentrāciju; ultrasonoskopija, doplerogrāfija, dinamiskā scintigrāfija transplantātam; virusoloģiskie izmeklējumi.
  20. 7. Iespējamās blaknes

  21. Iespējamās blaknes ir asiņošana, dažos pētījumos bijusi vairāk par 10%. Citi nozīmīgi sarežģījumi var būt vārtu vēnas un tās daļu tromboze. Saliņu šūnu transplantācijas gadījumā imunosupresijas īpatnība ir tā, ka visās shēmās netiek pielietoti kortikosteroīdi. Obligāta ir indukcija ar monoklonālām antivielām (anti-IL-receptor antibodies).
  22. Vērā ņemamas ir imunosupresijas terapijas daudzās blakusparādības: infekcijas, čūlas mutes dobumā un kuņģa zarnu traktā, hematoloģiski traucējumi (anēmijas, leikopēnijas), dislipidēmija, nieru funkciju traucējumi. Tās saistītas, pirmkārt, ar sirolimusa lielajām devām, kuras nepieciešamas, lai pārvarētu divas imunoloģiskās barjeras: allogēno un autoimūno. Kā perspektīvu var uzskatīt jaunu kombināciju un jaunu imunosupresoru meklēšanu.
  23. IV. MT pielietojuma nodrošināšanai nepieciešamie resursi

  24. Pasaules pieredzes saliņu šūnu transplantācijā analīze pierāda, ka jaunā tehnoloģija ir efektīva cukura diabēta ārstēšanas metode. Šāda ārstēšanas metode var tikt organizēta medicīnas iestādēs, kurās nodarbojas ar orgānu izņemšanu un transplantāciju, kurām ir pieredze cukura diabēta ārstēšanā un specializētās, šūnu kultivēšanai aprīkotās laboratorijās.
  25. Saliņu šūnu izdalīšanu un sagatavošanu transplantācijai, šūnu transplantācijas operāciju, indukcijas imūnsupresiju un pēcoperācijas perioda stacionāro ārstēšanu veic šūnu transplantācijas laboratorijas, transplantācijas un endokrinoloģijas nodaļu speciāli sagatavots un apmācīts personāls.
  26. 1. Ārstniecības personas:

  27. MT realizācijai nepieciešams operators – sertificēts ķirurgs transplantologs, kurš specializējies orgānu transplantācijas jomā, ar nepieciešamo pieredzi donora orgānu izņemšanā, izvērtēšanā un sagatavošanā; Operators – sertificēts radiologs vai endokrinologs, kurš specializējies orgānu transplantācijas jomā, ar nepieciešamo pieredzi šūnu tranplantācijā; Ārsti – endokrinologs, sertificēts ķirurgs, Sertificēts ķirurgs transplantalogs, transplantalogs; sertificēts ārsts laborants speciāli apmācīts morfoloģiskajiem un bioķīmiskiem izmeklējumiem, sertificēts anesteziologs-reanimatologs; Sertificēts endokrinologs, specializējies pacientu novērošanai pēc saliņu šūnu transplantācijas.
  28. Katrā šūnu transplantācijas operācijā jāpiedalās vismaz vienam sertificētam transplantologam un radiologam, kuri specializējies saliņu šūnu transplantācijā.
  29. Sertificēts imunologs;
  30. Biotehnologi (divi) bioloģijas maģistra grādu mikrobioloģijā un ar Latvijas mikrobioloģijas biedrības sertifikātu par papildus apmācību darbam ar audu un eikariotu šūnu kultivēšanu;
  31. Inženieris, Inženieris – pielietojamās medicīniskās aparatūras inženieris; inženieris speciāli apmācīts tīro telpu gaisa kvalitātes nodrošināšanai.
  32. Sertificēta operāciju māsa;
  33. Palīgpersonāls – medicīnas māsu palīgs vai sanitārs.
  34. 2. Ārstniecības līdzekļi:
    1. 2.1. Sterili vienreizlietojami operāciju veļas komplekti medicīniskajam personālam un operācijas laukam Donora aizkuņģa dziedzera izņemšanas operācijai.
    2. 2.2. Ķirurģisko instrumentu komplekts abdominālām operācijām: Codman tipa brūču plētējs, atraumatiskais šujamais materiāls, konservācijas šķīdums. Sterilas pincetes, šķēres, skavas, paplātes, šļirces.
    3. 2.3. Medicīnas ierīces saliņu šūnu izdalīšanai

 

 

Piegādāto preču nosaukums

Reģ. Apl. Nr.

Pielietojums

1.

Centrifūga Rotofix - 32, Hettich GmbH ar rotoru 1620A un 6 adapteriem 1451

30968

 

2.

Centrifūga Mikro - 120

30968

 

3.

Centrifūga ar dzesēšanu Mikro -

30968

 

4.

CO2 inkubators CB-150 BINDER GmbH, 2 gab.

30065

 

5.

Laminārais bokss S-KV-165, KOJAIR Tech Oy 4 gab.

31357

 

6.

Laboratorijas svari, digitālie

04468

 

7.

Analītiskie svari, 4-zīmju,

 

Reaģentu pagatavošani

8.

Laboratorijas mikseris

30112

 

9.

Magnētiskais maisītājs ar sildvirsmu MSH Basic IKA Werke GmbH, 2 gab.

 

Reaģentu pagatavošani

10.

pH metrs

31006

 

11.

Ūdens termostatvanna

 

Dziedzera fermentatīvās noārdīšanas nodrošināšanai

12.

Sausā gaisa žāvskapis, ED-53 BINDER GmbH, 2 gab.

03445

 

13.

Ledusskapji

004052-004053

 

14.

Dators termostatam ar CO2 ar programmatūru APT-COM Standard, BINDER GmbH, temperatūras monitoringam, 2 gab.

 

Termostata darbības nodrošināšanai

15.

Velkmes skapis

31357

 

16.

Invertmikroskops ar digitālu mikroskopa kameru, adapteri un datoru Leica DM IL, Leica Microsystems, 2 gab.

30209

 

17.

Datorizēts pētnieciskais invertmikroskops ar stacionāru digitalo dokumentēšanas kameru un attēlu analīzes un mērīšanas datorprogrammu Leica DMI 4000B, Leica Microsystems

30209

 

18.

Automātiskā pipete tilpumu diapazonam 0,2-2,0 ml,

50189

 

19.

Automātiskā pipete tilpumu diapazonam 2,0-20,0 ml,

20.

Automatiskā pipete tilpumu diapazonam 20-100 ml

21.

Automātiskā pipete tipumu diapazonam 50-200 ml,

22.

Automātiskā pipete tipumu diapazonam 200-1000 ml,

23.

Automātiskā pipete tilpumu diapazonam 1000-5000 ml,

24.

Pipetēšanas palīgs tilpumu diapazonam 1-100ml, ar lādētāju,

25.

Pipešu karuselis, 7 pipetēm, Gilson

 

 

26.

Peristaltiskais sūknis

 

Dziedzera fermentatīvās noārdīšanas šķīdumu pārpumpēšanai

27.

Autoklāvs

31304

 

28.

Sterilā veļa

 

 

29.

Sterilie cimdi

 

 

30.

Angiokateters dziedzera izdalīšanai 16.-18. lieluma

 

 

31.

Automātiskais inkubators

 

Nodrošina stabilu vidi šūnu augšanai

32.

Gēla dokumentācijas sistēma

 

DNS, RNS un proteīnu gēlu attēlošanai un arhivēšanai

33.

DNS amplifikators

 

Termociklers PCR veikšanai

34.

Plūsmas citometrs

 

Šūnu analīzei

35.

Vertikālā elektroforēzes sistēma Western blottam

 

Šūnu pārnesei no agarozas uz akrilamīda gēlu

36

Programmējamā cirkulējoša ūdens vanna ar dzesēšanu

 

Dziedzera fermentatīvās noārdīšanas nodrošināšanai

37.

Biomedicīniskā saldētava ar uzstādāmiem temperatūras režīmiem (kastes tipa)

 

 

38.

Ultra zemas temperatūras saldētava

 

 

39.

Aferēzes aparāts

 

Šūnu atdalīšanai un attīrīšanai Fikola gradientā

40.

Rikordi kamera

 

Dziedzera fermentatīvās noārdīšanas nodrošināšanai

41.

Ūdens attīrīšanas aparāts ar reversās osmozes metodi

 

Ūdens attīrīšanai

42.

Datorizēts caurejošās gaismas stateniskais mikroskops ar digitālo foto-kameru un attēla apstrādes programmu

 

 

43.

Datorizēts motorizēts invertais imūnfluorescences mikroskops ar digitālo foto-kameru un attēlu apstrādes programmu

 

 

44.

Autoklavējamās silikona caurules (iepakojums, dažāda izmēra, atkarībā no peristaltiskā sūkņa veida)

 

 

  1. 2.4. Sterili vienreizlietojami operāciju veļas komplekti medicīniskajam personālam un operācijas laukam Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas operācija recipientam: taisnais 4-F katetrs,
  2. 2.5. Magnētiskās rezonanses aparāts, ultrasonogrāfs
  3. 2.6. Reaģenti, zāles:
    1. 1) Hanks' balanced salts (HBSS; Sigma); UW vai HTK šķīdums; glikoze 5% sterils šķīdums i/v lietošanai; sterils, apirogēns ūdens;
    2. 2) Liberāze (Roche Applied Science, Cat. No. 11 666 720 001); Cilvēka albumīns; Heparīns nefrakcionēts
    3. 3) Dithizone (Sigma); Tripān zilais; DMSO; Lymphoprep
    4. 4) RPMI-1640, HEPES; M199 (Sigma),
    5. 5) FBS, heat inactivated (HyClone) sūta sausajā ledū,
    6. 6) Penicilīns G, Streptomicīns vai Pen-Strep (10000 U P, 10000 mg S), Amfotericīns B;
    7. 8) NaOH, nikotīnamīds,
    8. NaHCO3, ledus etiķskābe, Na acetāts. BSA
    9. 9) Celulozes acetāta filtri ar poru diametru 0,22 mm; Centrifūgas mēģenes 50 ml (Falcon), sterilas 30 ml 500 ml 1000 ml tilpuma mērglāzes, mērkolbas, trauki
    10. 10) Mikrobioloģiskās barotnes: NA, R2A, iesala agars; Nutrient agar barotne Petri traukos; R2A barotne Petri traukos; Iesala agara barotne Petri traukos
    11. 11) 5 % polividona joda (polyvidonum iodine) šķīdums.
  4. 2.7. Ledus gabaliņi –20 °C
  5. 2.8. CO2 balons
  6. 3. Telpas un to tehniskais aprīkojums
    1. 3.1. Telpas donora orgāna izņemšanai un sagatavošanai transportēšanai, telpas Langerhansa saliņu šūnu transplantācijas operācijai. Operāciju zāles, intensīvās terapijas, invazīvās radioloģijas, transplantoloģijas, endokrinoloģijas un anestezioloģijas nodaļas aprīkojums atbilstoši obligātajām prasībām ārstniecības iestādēm un to struktūrvienībām;
    2. 3.2. Telpas šūnu saliņu izdalīšanai.
    3. Donora aizkuņģa dziedzera apstrādei jānotiek aseptiskos apstākļos, kritiskajās zonās - bioloģiskajās kamerās ar lamināro gaisa plūsmu. Laboratorijā jābūt divām darba vietām (tīrās telpas ar bioloģiskajām kamerām), mazgātavai, sterilo šķīdumu pagatavošanas telpai, materiālu istabai, noliktavai, kontroles laboratorijai, šūnu uzglabāšanas telpai, personāla istabai, garderobei, atkritumu uzglabāšanas telpa, sanitārajam mezglam.
  7. 06-014